这种体内模拟系统的进一步整合可能最终弥合标准细胞培养和动物研究之间的差距。

  外力在细胞组织、命运和稳态中发挥着复杂的作用。这些外力的变化，或细胞对其响应方式，会导致胚胎发育异常和成年人的疾病。要知道细胞如何感知并响应这些机械刺激，首先要了解蛋白质构象变化的基础及其导致细胞与组织器官的组织和功能发生明显的变化的生物物理学原理。在这里，我们讨论了适用于蛋白质构象、细胞组织和多细胞（组织）功能的机械转导。

  身体的所有细胞和组织都收到外部作用力的影响。这些可能包括流体剪切力(如在血管系统中)、渗透力(在尿路中)、机械负荷(在骨骼和肌肉中)和拉伸(在肺和肠道中)，以及包裹大多数细胞的细胞外基质(ECM)的刚度。这些外力会影响细胞的形状及细胞内组织，细胞的增殖和迁移，以及细胞间的相互作用；它们影响胚胎的发育以及成人的功能和稳态。此外，许多疾病状态（包括心脏肥大、关节硬化和癌症）是以这些力量的异常改变或正常细胞对其响应的丧失为特征[1，2]。了解这些外力的性质以及细胞如何感知并如何对其做出适当响应是一个复杂的问题，其范围涵盖从蛋白质构象(丝-纳米)到细胞组织(纳米-毫米)和多细胞功能(毫米-毫米-厘米)。

  机械转导可定义为将机械传入，例如拉伸或流体流动，转化为细胞内信号转导的细胞进程。机械转导的详细分子机制可能是复杂的。然而，一些基本的物理原理就足以理解机械转导是如何发生的。

  在已充分研究的机械转导实例中，特定蛋白在构象上产生了由（机械）力诱导的变化，这些变化与催化活性或结合物亲和力的变化有关（图1）。通过这一种方式，机械负荷引发了生化变化，这些变化可通过典型的信号转导途径传播（见蛋白质和细胞水平部分）。为了更准确地理解蛋白质是如何 感受 到力的，回顾一下机械做功，一种能量形式，可以用焦耳或牛顿米（力乘以距离）表示。直观地说，克服阻力将一个物体移动一段距离需要能量输入。在分子水平上也是同理可证：克服2皮牛载荷（pN；单个肌凝蛋白产生的阻力）拉伸两纳米的蛋白（nm；典型蛋白尺寸）需输入4仄普托焦耳（zJ；4×10-21焦耳）。

  仄普托焦耳（zeptoJoule）是一种很难来想象的小能量，但它可与直观的物理量联系起来。如上所述，相对于克服2 皮牛（pN）的阻力拉伸1摩尔蛋白质（6.02×1023个分子）所需的功是4×10-21 J×6.02×1023，或每摩尔2.4 千焦（kJ）。这是很大还是很小？事实上，这种能量大约比生理条件下三磷酸腺苷（ATP）水解所产生的能量少20倍。事实上，其大小与蛋白质在环境条件下所承受热力产生的推挤相当(见图1)。

  为了了解细胞如何克服这一挑战，我们大家可以利用分子水平上的机械功和化学自由能的等价性。蛋白质以各自不同状态依其相对能量而分布的构象平衡的方式存在。机械力可转换这些预置状态间的平衡（图1）。重要的是，两种状态间的平衡与所施加力呈指数型相关。在上面的例子中，2pN作用在2纳米上将使构象平衡发生2.6倍的变化。更大的力会显著转换平衡：10pN（约5个肌凝蛋白）作用在2pN上会使平衡产生130倍的转变。总之，即使是由单个运动蛋白产生的非常小的力也能改变一个构象平衡，这足以潜在地调节下游信号传递。较大力可以极大地改变感受器蛋白的构象，从而改变信号转导。

  图1. 机械力影响蛋白质构象平衡。蛋白质以各自不同状态依其相对能量而分布的构象平衡的方式存在。机械力可转换这些预置状态间的平衡。思考一个蛋白质在A(蓝色)和B(红色)的紧密构象和延展构象间的平衡。相应的平衡常数K = [B]/[A]与状态间自由能差∆G的关系为：K = exp(﹣∆G / kBT)，其中kB为玻尔兹曼常数，T为绝对温度。施加的载荷F通过F乘以距离的机械功项δ来稳定延展构象，从而得到一个新的平衡常数K’= exp[(-∆ G+Fδ/kBT] [4]。实际上，力改变了紧致态和延展态间的能量平衡，在上图中，延展构象中的蛋白质数量增加了五倍。需要记住的是，由于kBT具有能量单位，它可以用力乘以距离的单位表示，在生理温度下是4.2 pN nm。因此，作用在纳米距离上的pN力足以令构象间平衡发生有意义的改变。

  在大多数情况下，机械负荷会加速蛋白质-配位键的解离。然而，各种细胞黏附蛋白表现出键合行为[1]，其中机械负荷引起蛋白质构象的变化，从而引发结合配偶体的更高亲和力(参见关于蛋白质和细胞的章节)[3，4]。此外，一些肌凝蛋白(例如，肌凝蛋白I、II、V和VI) 在机械负荷下对腺苷二磷酸有更高的亲和力。这增加了它们与肌动蛋白结合的催化循环比，因此导致它们随着负荷的增加而从分子转运载体转变为细胞骨架锚[5-11]。根据特定蛋白质-配体对的不同，负荷可破坏或稳定蛋白质-配体的相互作用，这一事实为机械负荷调节下游信号提供了丰富的可能性(参见蛋白质和细胞水平的章节)。

  上述机械转导仅技术性适用于系统处于伪平衡状态时。在足够短的时间尺度上(小于毫秒)，蛋白质构象的变化将无法跟上快速变化的外力，导致基于平衡的模型失效。有趣的是，这些时间尺度是肌肉收缩、听觉和触觉中机械转导的特征。理论上的进步已为建立蛋白质如何响应快速变化的外力与更易测得的平衡热力学属性的关系提供了坚实基础，例如，RNA和蛋白质的机械展开的场景[12-14]。除了少数例子，非平衡统计力学的理论方法还未应用于细胞机械转导的研究[15]。在单分子生物物理学背景下开发的理论工具可能对机械生物学家有用，特别是那些研究快速动态生理系统的学者，如上述举例。

  理解基础物理原理是如何在蛋白质构象中编码的是理解（机械）力怎么样转化为生物化学信号的核心[1,3-11]。乍一看，我们通过晶体学等结构方法观察到的蛋白质构象与我们在细胞中看到的力依赖性功能变化之间的关系并不明显。然而，如果将（机械）力视为改变预置功能状态间平衡的变构调节器，那么晶体捕获的结构可能反映出仅在机械负载内显著分布的构象。此外，当(机械)力与蛋白质对其配体亲和力的增加相关联时（例如，在键合作用中），配体饱和浓度的出现会改变平衡而呈现为力依赖性构象--正如由细菌粘附蛋白FimH结构分析已证明的：FimH形成细菌粘附结构尖端，称为菌毛[16]，以及哺乳动物的粘附蛋白选择素[17]和整联蛋白[18,19]。

  实证法已检验了以下想法：给定的晶体结构可能代表力依懒性活化通路上的一种构象。例如，通过向蛋白质中引入二硫键，可以共价“锁定”特定构象，然后测试其结合亲和力的力依赖性变化是否受到抑制（这种方法已用于纤连蛋白[20])。也可以将突变引入蛋白质中，以破坏被认为参与力诱导激活通路的界面（用于选择素 [21-23]）。或者，在存在促力依赖性配体结合的抗体的情况下，可通过电子显微镜或溶液散射方法检验测试蛋白质构象（正如检测整合素一样[24]）。这一些数据支持晶体结构可呈现力依赖性构象的观点。

  结构研究表明，力敏感蛋白具有多个结构域和灵活的域间界面，允许蛋白质通过(或‘样品’)多个构象。例如，弯曲或钩状的构象可沿作用力方向展开更直的结构域排列；这样蛋白质远端区域就可充当杠杆臂，用以传递打开界面所需的力并促进所需的构象变化。已在FimH[25]以及选择素和整合素[24，26]中观察到这样的结构变化。在这些实例中，可通过调节杠杆臂的长度和柔性来“调整”力的响应性。产生的界面变化被传递到结构域的远端部分，并影响配体结合。

  力诱导的构象状态可以多种方式来进行偶联。例如，细菌粘附蛋白FimH上的张力改变了其N端凝集素样结构域及其纤毛蛋白结构域之间的界面。这导致凝集素结构β桶的延伸和变窄，从而稳定了该结构域对端的高亲和力甘露糖结合位点[16,25]。以类似方式，力诱导的L-选择素的变化重塑糖结合位点：N端凝集素和EGF样结构域之间的相互作用与凝集素结构域中连接二级结构元素的环的变化相耦合[23,26]。对整合素β链配体结合域（所谓的 头部开口）施加的力也将一个相对弯曲的双域结构转变为一个直的结构[24]。这种变化导致β链中平行于细胞表面的较刚性的结构域发生75埃的移动，从而与α亚基广泛分离。

  除了上述构象重塑的例子外，力诱导的蛋白质部分展开可暴露配体的其他隐性结合位点(图2)。一个充分研究的例子是粘着斑蛋白踝蛋白(另见下一节)，其中N端FERM结构域与整联蛋白β亚基的胞质尾结合，C端五螺旋束结构域与肌动蛋白结合[27]。这两个区域由一个大型杆域连接，该杆域由一系列螺旋束组成，在没有力的情况下，该杆域相对紧凑但具有柔性[28–30]。

  肌动球蛋白收缩施加的力导致杆状结构域中的螺旋束展开，暴露出纽蛋白的结合位点。然后，纽蛋白与这些位点的结合稳定了重组结构，其中一个踝蛋白螺旋与四个纽蛋白螺旋形成五螺旋束[28，30，31]。因此，作用力改变了构象平衡，使其有利于“暴露”的纽蛋白结合螺旋。在血管性假血友病因子和纤连蛋白中观察到了因施加作用力而暴露的隐性结合位点的其他例子[32，33]。

  发生上述重组类型的蛋白质结构域的稳定性必须是这样的:构象平衡仅在适当的力阈值时发生显著变化，但也必须足以避免在最高相关力下发生变性。因此，可发生明显的变化的蛋白质结构域很可能被调节到有限的生理力范围。力对蛋白质构象的影响也可能延伸到更高级的组装体。支架蛋白，如踝蛋白募集激酶、磷酸酶、GTP交换因子(GEF)和连接粘附位点的GTP酶激活蛋白(GAP)。机械张力可能改变这些结合信号分子的相互作用：例如，作用在结合激酶及其底物的支架蛋白上的力可能令靶蛋白磷酸化或去磷酸化。

  在许多大型蛋白质组装体和亚细胞结构中产生响应机械力的构象变化，这可能会引起细胞组织、行为、增殖和分化的局部和整体变化。尽管很多类型的膜组织，如细胞膜穴样内陷 [34,35] 和由含 BAR 结构域的蛋白质引起的膜弯曲 [36] 对细胞表面的机械力有反应，但在这里我们将着重关注细胞与细胞外基质的粘附。在单细胞粘附于细胞外基质(图3) [1]和多细胞组织[37](参见多细胞水平一节)的背景下，已在组织培养中广泛研究了细胞如何感知外力并将其转化为细胞内信号。

  图3 联结细胞表面力与细胞内信号传递和下游效应器的通路。质膜中机械感应器检测到外力，其与细胞内适配器相连，将机械信号传递给细胞内靶点。右图:相关过程和蛋白质的例子。这些通路可能表现出反馈调节

  正如我们在上面所看到的，许多将来自细胞外基质的外力与细胞内信号通路联系起来的蛋白质的一个特征是，它们在响应力或张力时发生解折叠。纤连蛋白是细胞外基质的主要成分，具有其他细胞外基质蛋白和整联蛋白的多个结合位点。纤连蛋白在体内[38]和体外[39]拉伸时会发生构象变化(解折叠)。这导致隐藏在折叠结构域中的结合位点的暴露，以及暴露在折叠结构域表面的结合位点的失活。最终，拉伸改变了细胞外基质的组织，从而改变了细胞外基质成分与细胞膜中整合素的结合。当整合素在结合细胞外基质中的细胞外配体时也会发生构象变化，导致其从弱亲和力结合构象转变为高亲和力结合构象[40]，与捕捉键行为一致[1](参见生物物理原理一节)。

  大量胞质蛋白要么直接与整合素结合(例如，踝蛋白)，要么在整合素周围局部募集(例如，黏着斑蛋白、p130cas、斑联蛋白和细丝蛋白A) [41]。这些蛋白质一起组装成一个与肌动球蛋白细胞骨架相连的黏着斑复合物。踝蛋白和p130cas发生张力介导的解折叠，导致其它结合位点暴露，如整合素中的黏着斑蛋白结合位点[42](“蛋白质水平”章节中已讨论)，或由p130cas的Src介导磷酸化的修饰结合位点[43]。采用福斯振能量转移(FRET)张力传感器(TsMod)的研究也表明，黏着斑蛋白在黏着处呈现张力态[44]。最终，通过聚集整合素和募集肌球蛋白细胞骨架的蛋白质的募集和修饰，强化了细胞外基质-整合素的黏附[45]。然而，仅有一部分这样的络合物可能在机械力的作用下而稳定下来。其他与肌动蛋白相关的蛋白-蛋白相互作用可能是 滑移键，它们在力的作用下解除结合，导致蛋白络合物的解体和力的局部耗散。

  黏着斑复合物的力介导重组导致Rho家族小GTP酶调控的变化。例如，Rac-GAP FilGAP以张力依赖的方式从细丝蛋白A中释放，并可能局部降低Rac控制的肌动蛋白和膜活性[46]。相比之下，作用于蛋白的力激活Rho-GEFs LARG和GEF-H1并可能局部增加Rho-依赖性肌动球蛋白的收缩性[47]。

  肌动蛋白细胞骨架的组织和收缩性的改变为下游目标提供了短程和远程的力传递(图3)。

  短程传递改变了粘着斑的组织和细胞与细胞外基质结合的强度[1]，而长程传播改变了细胞的形状[48]，宿命和功能[49]。一个重要的靶点是细胞核和基因表达的调控[50]。细胞骨架的所有元素都与一种称为核骨架和细胞骨架连接物(LINC)的蛋白复合物结合，该复合物连接核膜[51]。这种复合物介导穿过核包膜的力传递，导致核变形 [52] 和影响基因表达的染色质结构和组织的改变 [53]。许多肌肉组织疾病(肌营养不良和心肌病)是由LINC复合物成分的突变引起的[54]。细胞核和细胞骨架之间的偶联对于细胞迁移、伤口愈合、癌症转移和[55]的发育至关重要，[56]中综述了这一过程。

  力是如何通过细胞间粘附整合的还不太清楚[2]，但初步有所进展[57-61](参见最新综述[62，63])。例如，采用TsMod FRET传感器的最新研究[44]来检测培养细胞[59] 和果蝇卵巢迁移过程的边界细胞[64]中细胞间粘附蛋白上皮钙粘蛋白的胞浆区域上的肌动球蛋白依赖性张力。细胞-细胞外基质结合中确定的许多基础原理可能适用于细胞间黏附复合物。最近的一项研究表明，钙粘素-连环素黏附复合物中的α-连环素在力的作用下与肌动蛋白结合，是一种捕获键[65]。

  虽然可利用影像和生物化学法来分析所培养细胞的力诱导效应，并且可通过药物或蛋白质耗竭来操纵，但一直难以使用这一些方法来分析体内组织稳态[66] 。然而，随着在模拟体内的细胞外基质硬度的特殊表面上生长多细胞结构和组织的方法的进步，以及使用应力阵列在体外以可控方式诱导跨组织的应力，这种情况正在迅速改变。

  自20世纪30年代以来，通过将细胞植入人工设计的机械环境[67]，通过使用饲养层产生软基质[68]，以及通过机械刺激外植细胞的工程方法[69]研究了外力对细胞阵列的影响。其他研究采用了静态技术，如细胞图案化(细胞在确定的形状和表面区域上生长)、调节基底硬度或被动力测量。这些结果与细胞迁移和干细胞分化等功能结果相关[49，70]。此外，一些生物体可在修正载荷下(如压缩、激光解剖和接触探针)，对组织成形进行直接扰动和观察[71–73]。要全面了解组织间和组织内的力传递，需使用定量工具来应用和测量力和变形的动态、综合方法。

  图4 细胞-细胞连接处的力转递分析。在已知硬度的水凝胶上生长的单层上皮细胞中，细胞-细胞粘附物连接将一个细胞与另一个细胞机械地连接起来。这些连接体包括跨膜钙粘蛋白，它们在胞内空间以及在质膜的细胞质表面彼此结合，与αE-和β-连环蛋白形成三元复合物；张力感应模块中肌动蛋白细胞骨架和其他蛋白质的连接蛋白的分子特性仍然未知。将弗赫斯振能量转移(FRET)探针植入关键蛋白质，就能定量地测量细胞在响应致动器施加的宏观拉伸时对彼此间作用的分子级力。

  一个主要的挑战是理解细胞如何在细胞-细胞外基质和细胞-细胞接触之间分配载荷(图4)。在多细胞结构的情况下，要推断任何一个细胞所感受到的力是特别困难的。例如，在组织水平上观察到上皮薄片迁移[74]或上皮管折叠[75]过程中的机械力，但与细胞中的亚细胞通路无关。然而，我们知道载荷或机械环境的变化确实调节了许多细胞内通路，例如，细胞骨架或细胞增殖的变化，以及细胞功能的变化，如内皮通透性增加和白细胞转运[76]。

  机械力[77，78]和蛋白图案化([79]中综述)可确定多细胞阵列中细胞的排列，这反过来又可影响肌肉细胞收缩[80]和钙处理[81]等功能。有趣的是，这两种组织因素--机械排列和蛋白图案化--都会引起相似的基因表达模式[82]。相反，作用在平行或垂直于细胞排列的动态或稳定流体力激活不同的信号传导程序[60]。这些双重刺激实验表明，我们才刚开始认识到细胞外基质-细胞表面线索、组织拓扑结构和应变史在发育和疾病中的可能重要性。因此，细胞共培养与双重刺激机械环境的结合可能为创建功能组织模型开辟新的途径。

  微制备装置(用于在受控条件下研究细胞与组织的结构和功能的厘米-毫米-毫米尺度的微型制备装置)非常适合于在细胞(纳米-毫米)和多细胞(毫米-毫米)尺度上施加生理范围内纳牛-毫牛的力。可测量细胞的位移，且可参照材料属性模型(如，弹性基底材料的硬度或杨氏模量)以推断出机械力[83]。例如，细胞-基质牵引力的量化可通过悬浮在聚合物水凝胶中的珠子的位移来跟踪[84-88]，或，通过由一种低杨氏模量的粘弹性聚合物的弹性体所制成的微柱的变形来跟踪 [89，90]。已经使用类似的方法来计算细胞-细胞接触的力以及细胞-细胞外基质与细胞-细胞的接触力间的相互作用[91-93]。基于弹性体和水凝胶(一种透光、柔性的交联型亲水聚合物)平台特别成功，因为它们的材料特性能非常好得适配细胞或组织的硬度(pa-Mpa范围内)和弹性应变(0.01%-100%)[94]；然而，如果这些平台能与其它生理动态检测相结合会更有益。

  需要机械驱动装置来提供外力对细胞生长、分化和成熟的影响的相关量化措施。例如，循环拉伸的穿孔膜微流控设备(也称为“器官芯片”，一种模拟器官活动、力学和生理反应的三维微流控细胞培养芯片)已与内皮细胞和上皮细胞一起使用，以模拟人类肺气血屏障[95]。这些“肺心片”研究发现，拉伸增强了细胞对纳米粒子暴露的炎症反应，突出了采用生理相关机械刺激的重要性。当来自发育中的唾液腺[96,97]、肾脏[98]、[99]、肠道[100]或泪腺[101]的分离上皮细胞被包埋在重组基底膜蛋白的三维凝胶中时，它们在外源性生长因子的存在下形成分支（在[102-104]中综述）。同样，在重组的乳腺上皮中，上皮施加的机械应力启动新生分支并引导分支化形态生成[105,106]。还可诱导组织培养细胞系在适当的三维基质环境中分化成三维结构（例如形成 肠道芯片[107]）。可扩展这一些方法用于建立由相互连接的隔室组成的集成“人类芯片”模型，其中每个隔室包含来自特定细胞类型且由微流体循环系统连接的不同器官[108]。

  这种体内模拟系统的进一步整合可能最终弥合标准细胞培养和动物研究之间的差距。需要结构生物学家、生物物理学家、细胞生物学家和机械工程师之间的合作以建立这些新系统，以便能广泛得理解分子水平上的结构变化如何导致组织和整个生物体的功能变化。